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決定超高分辨率熒光顯微鏡成像質(zhì)量的幾個(gè)因素
更新時(shí)間：2019-12-25
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超高分辨率熒光顯微鏡的成像質(zhì)量主要取決于像的襯度和像的亮度, 像的襯度是由樣品中激發(fā)出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過(guò)截止激發(fā)光的濾色片的雜散激發(fā)光, 樣品組織成分的自發(fā)熒光和光學(xué)系統(tǒng)的自發(fā)熒光和雜散光, 在熒光顯微術(shù)中盡全力要解決的是既獲得*的像襯度, 同時(shí)又維持像有足夠亮度, 這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發(fā)時(shí)僅利用了極少的光能, 背景暗了但熒光亮度也弱了。在應(yīng)用時(shí), 只能兼顧, 合理的權(quán)衡以決定取舍。
超高分辨率熒光顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)需要優(yōu)先考慮的是:
(1) 光學(xué)系統(tǒng)組成的材料應(yīng)選用在激發(fā)光波內(nèi)無(wú)熒光材料, 不但指光學(xué)系統(tǒng)玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發(fā)熒光, 不但會(huì)增加背景光, 有時(shí)還會(huì)混淆觀察熒光圖像。
(2) 光學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)選擇中, 應(yīng)將獲得zui大光能作為di一考慮因素。
照明系統(tǒng)中集光鏡應(yīng)選用zui大的包容角; 采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿(mǎn)入瞳, 以期望獲得高效率的均勻照明。
收集熒光成像的物鏡, 因?yàn)橄衩嬲斩扰c數(shù)值孔徑NA 2 成正式, 為此作為熒光用物鏡應(yīng)有較大的NA值。目*×已達(dá)015; 20×達(dá)0175; 40×達(dá)019; 油鏡40×達(dá)113。
雙目鏡筒作為熒光用時(shí)應(yīng)在可見(jiàn)光譜段有較高的透過(guò)率, 采用鍍膜技術(shù)可大大地減少光能的損失, 它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍, 這對(duì)弱熒光物質(zhì)觀察是必須的。
目鏡放大率不宜選大, 因?yàn)橄竺嬲斩扰c目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同, 當(dāng)用613×目鏡時(shí),照度定為100% , 換上1215×時(shí), 照度約為25% , 因此常在4×～ 613×之間選用。
由此表明, 用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時(shí), 象面照度和曝光系數(shù)可相差數(shù)倍, 對(duì)于熒光觀察*組合是選用低倍率目鏡和NA 大的物鏡zui為合適。
(3) 作為熒光光學(xué)系統(tǒng)各組成部件的光譜特性也是至關(guān)重要的, 特別是紫外光要通過(guò)的部件, 如照明系統(tǒng), 聚光鏡以及物鏡, 要關(guān)注紫光區(qū)的透射系數(shù)。聚光鏡要選用透紫外線(xiàn)的材料。照明系統(tǒng)中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好, 因?yàn)殇X在UV 和V 區(qū)反射率在90% 以上, 而銀僅達(dá)70%。加拿大膠吸收紫外線(xiàn), 在紫外區(qū)通過(guò)處不宜用作膠合劑。
